Durabilidad de la capacidad germinativa del polen en Aloe vera y A saponaria

INTRODUCCIÓN

La viabilidad de los granos de polen ex situ, usualmente es determinada empleando métodos de tinción con colorantes como acetocarmín, yoduro de potasio, azul de metileno y fucsina básica, orceína, búfalo black, etc. (Singh, 2003). En estas pruebas, se consideran granos de polen viables a los intensamente coloreados y estériles a los menos coloreados o acromáticos (Marks, 1954; Cequea, 1985). No obstante, la mayoría de estos métodos se basan en la afinidad de las células por determinadas sustancias colorantes, que generalmente sobrestiman la fertilidad del polen y escasamente pueden determinar el poder germinativo real de los granos de polen o la capacidad de extensión de los tubos polínicos (Jahier, 1996). Para evaluar con mayor precisión la fertilidad masculina de numerosas especies vegetales se han establecido procedimientos in vitro que hacen posible la germinación del polen bajo condiciones controladas (Hodgkin, 1983; Heslop-Harrison, 1987; Schoper et al., 1987; Steer y Steer, 1989; Pierson y Cresti, 1992; Singh, 2003).

La familia Aloaceae comprende a los géneros Aloe, Gasteria, Haworthia, Lomatophyllum, Chortolirion, Poellnitzia y Astroloba, con casi 700 especies, nativas de África, Madagascar, Arabia e islas del Océano Índico (Carter, 1994; Rowley, 1997; Smith y Steyn, 2004). Dentro de este grupo vegetal, Aloe vera (L.) Burm.f. (= A. barbadensis Mill.), conocida popularmente como sábila o zábila, se destaca como una de las especies de mayor importancia económica a nivel mundial, debido a sus múltiples propiedades medicinales (Añez y Vásquez, 2005). En América, esta planta fue introducida durante la ocupación española y actualmente se cultiva desde el sur de Estados Unidos hasta el norte de Argentina, explotándose principalmente en la industria de cosméticos, fármacos, alimentos y bebidas terapéuticas (Davis, 1997; Judd et al., 1999).

La creciente incidencia de bacteriosis en plantaciones de A. vera localizadas en Aruba (De Laat et al., 1994), México (Aranda y Fucikovsky, 1999) y Venezuela (González et al., 1998; Hernández et al., 1999, 2001; Lugo, 1999; Contreras et al., 2001; Lugo y Medina, 2001; Guevara et al., 2002; Guevara, 2004), han promovido la realización de investigaciones que conduzcan a la obtención de variedades promisorias. Los alcances del programa de mejoramiento que se desarrolla en el laboratorio de genética vegetal de la Universidad de Oriente (Cumaná-Venezuela), comprenden la evaluación inicial de variabilidad genética entre las poblaciones locales (Albornoz y Imery, 2003), inducción de mutaciones (Imery, 2000; Imery y Cequea, 2001a; Imery, 2006b), evaluación de estabilidad cromosómica en tetraploides artificiales (Imery y Cequea, 2001b), hibridación y caracterización de progenies con diferentes niveles de ploidía (Imery, 2006a) y otros estudios complementarios, como el reconocimiento de congéneres que puedan ser utilizados como donadores de la tolerancia a Erwinia chrysanthemi (Salmerón y Imery, 2004, 2005), anormalidades reproductivas (Imery, 2001, 2002, 2004; Imery y Cequea, 2002; Velásquez y Imery, 2004, 2005) y determinación de cruzabilidad interespecífica (Imery, 2005).

La necesidad de continuar generando variabilidad genética en A. vera y en una de sus potenciales donadoras (A. saponaria), conlleva a considerar el tratamiento de granos de polen con radiaciones ionizantes, antes de ejecutar futuros cruzamientos intra e interespecíficos. No obstante, para el traslado de estas células reproductivas hacia los centros de irradiación, se requiere de tiempo y condiciones de almacenamiento, que hasta ahora se desconocen. En este sentido, el objetivo del presente trabajo fue evaluar (in vitro) los efectos del tiempo de almacenamiento post-antesis sobre la capacidad germinativa del polen de A. vera y A. saponaria.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Todas las plantas empleadas en este trabajo se conservan en la colección in vivo de especies suculentas (UDO-Biología), bajo los registros 104/0096 (A. saponaria) y 129/0187 (A. vera). Los especimenes fundadores provenían originalmente de viveros comerciales (A. saponaria) y de una población ubicada a 10°36’34’’ N, 64°07’18’’ O (A. vera), los cuales fueron identificados morfológicamente según Carter (1994) y Van-Wyk y Smith (1996). En diciembre de 2004, se seleccionaron 20 plantas de cada especie, libres de enfermedades y con presencia de inflorescencias prominentes en inicio de floración. Al momento de la colecta (6:30 a 7:15 a.m.), se eligieron flores que presentaran una o más anteras sin abrir. Estas flores fueron depositadas en frasco seco y trasladadas inmediatamente al laboratorio para monitorear la dehiscencia del resto de las anteras y colectar el polen. Se emplearon pinceles suaves para remover todo el contenido de las anteras y depositarlo dentro de cápsulas de Petri. Las cápsulas fueron selladas con parafilm y almacenadas durante 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 h, en lugar oscuro y fresco (a 24 º C, dentro de estantes cerrados y esterilizados con hipoclorito de sodio 1,5 % v/v), antes de realizar los cultivos in vitro. En esta investigación la antesis fue definida como el momento en el cual abre el perianto y expone las anteras (Badillo et al., 1985). Por otra parte, tomando en cuenta que el polen colectado provenía de flores en antesis, los tiempos de almacenamiento del polen fueron identificados como tiempos después de antesis (TDA).

Microcultivos

Se siguió la metodología propuesta por Sunderland y Roberts (1977), con algunas modificaciones estandarizadas por los autores. Se preparó una mezcla homogénea de agua de grifo, agar-agar (4 g.l^-1) y sacarosa (0,06 mol. l^-1), la cual fue esterilizada en autoclave a 15 atm por 15 min y vertida sobre portaobjetos horadados minutos antes de iniciar el cultivo. Se dispersó el polen sobre los medios de cultivo, cuantificando el tiempo desde el contacto con esta superficie hasta la germinación de al menos 1 % de los granos de polen, observados en un campo microscópico fijo. Se dejaron a ambiente de laboratorio por 60 min (sobre el mesón a 24 º C y cubiertos por cápsula de Petri para evitar la desecación y contaminación). Se evaluaron las láminas a 100X, bajo contraste de luz en un microscopio Bausch y Lomb PBV-4B, considerando a un grano de polen como germinado cuando su eje polar resultaba menor o igual a la longitud del tubo polínico emitido (Kalinganire et al., 2000). Como ensayo preliminar, se evaluó el crecimiento del tubo polínico durante 60 min de cultivo in vitro, en una muestra fija de granos de polen colectados al momento de la antesis. Esta evaluación se realizó cada 5 min en 10 láminas por especie. El recuento de granos de polen germinados (GPG) y no germinados (GPNG) se utilizó para calcular el porcentaje de germinación en cada campo de observación (%G=GPG/(GPG+GPNG). Todos los materiales y utensilios utilizados en este trabajo fueron debidamente esterilizados en autoclave antes de su utilización.

Diseño experimental

El experimento se planificó originalmente bajo un diseño de bloques al azar con cinco repeticiones y arreglo factorial entre especies y TDA. De esta manera se analizó el porcentaje de germinación del polen; sin embargo, el agotamiento de la respuesta germinativa en una de las especies dificultó la determinación de posibles efectos de interacción de ambos factores sobre el tiempo de germinación del polen, razón por la cual esta variable fue examinada bajo un diseño de bloques al azar, en donde las combinaciones especie-TDA fueron consideradas de forma integral como tratamientos. El procesamiento estadístico incluyó ANOVA, regresión y prueba de ámbitos múltiples de Duncan a un nivel de significación del 5 % (Sokal y Rohlf, 1979).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En esta investigación, el medio de cultivo a base de agar y sacarosa ofreció suficiente consistencia, concentración y suministro de minerales para promover la germinación in vitro de los granos de polen de A. vera y A. saponaria (Figura 1). Durante la primera hora de cultivo, los tubos polínicos emitidos por algunos granos de polen colectados al momento de la antesis, se extendieron hasta 106,7 ± 24,8 μm en A. vera y 165,6 ± 22,5 μm en A. saponaria (Figura 2). En muchas angiospermas, la velocidad del crecimiento del tubo polínico in vitro varía de 60 a 20000 µm.h^-1 (Bryndum y Hedegart, 1969; Hoekstra, 1983). Esto es aproximadamente el 10 % de lo observado in vivo (Brewbaker y Majumdar, 1961); sin embargo, es un estimador útil de la viabilidad del polen en experimentos comparativos. En base a esto, las observaciones realizadas durante la primera hora de cultivo, sugieren que A. saponaria presenta inicialmente un mayor potencial reproductivo, debido al crecimiento superior de sus tubos polínicos, que se traduce en mayores expectativas de transportar con éxito los gametos masculinos. Estas diferencias pueden estar relacionadas con la existencia de algunas anormalidades genéticas en la microsporogénesis de A. vera (Imery, 2002, 2004), lo cual incide sobre la fertilidad del polen (Jackson, 1976, 1985; Cequea, 1985; Cequea et al., 2003) y, por consiguiente, debe afectar también su respuesta germinativa bajo las condiciones experimentales de este trabajo.

Cuadro de texto:

Figura 1. Granos de polen de Aloe saponaria almacenados durante 12 h y cultivados en medio a base de agar y sacarosa. Barra = 50 μm.

Cuadro de texto:
Figura 2. Crecimiento del tubo polínico (μm) en granos de polen de Aloe vera y A. saponaria, colectados al momento de la antesis y evaluados durante 60 min de cultivo in vitro.

La determinación de los efectos del almacenamiento, se realizó en 3497 ± 406 granos de polen en cada combinación de especie-TDA. La capacidad germinativa de estas células reproductivas, manifestó una considerable dependencia con respecto al TDA en ambas especies de Aloe (Figura 3). El porcentaje de germinación en A. vera, se redujo progresivamente desde 51 %, al momento de la antesis (0 h), a 46 % durante las primeras 24 h y luego declinó aceleradamente hasta su inhibición completa entre las 120 y 144 h. En A. saponaria, esta tendencia fue aún más acentuada, descendiendo la germinación por debajo del 40 % a partir de las 12 h, con inhibición completa entre 72 y 96 h (Figura 3a). Esta variabilidad intrínseca de las especies y su interacción con los TDA fue reflejada en el análisis de varianza (cuadro 1) y detallada por la comparación de promedios (cuadro 2). De igual manera, el tiempo de germinación también manifestó diferencias significativas entre los tratamientos (cuadros 3 y 4), aumentando proporcionalmente entre las 0 a 12 h de almacenamiento en ambas especies, continuando así con ligeras variaciones en A. vera; mientras aumenta abruptamente en A. saponaria, haciéndose más notable a las 48 y 72 h (Figura 3b). Ninguna de las especies de Aloe registró germinación de polen por encima de las 144 h después de la antesis.

Figura 3. Porcentaje (a) y tiempo (b) de germinación del polen de Aloe vera y A. saponaria, bajo condiciones in vitro y a diferentes tiempos después de la antesis. Líneas continuas indican modelos de regresión con sus respectivas fórmulas.

(b)

(b)

Cuadro 1. Análisis de varianza para el porcentaje de germinación del polen de Aloe vera y A. saponaria, bajo condiciones in vitro y diferentes tiempos después de la antesis.
Fuente de variación	Grados de libertad	Suma de cuadrados	Cuadrados Medios	F
Repeticiones	4	0,00011	0,000028	1,01 ns
Especies (A)	1	0,68483	0,684830	24468,57 *
TDA (B)	11	8,96249	0,814772	29111,44 *
A * B	4	0,63804	0,058004	2072,45 *
Error Experimental	92	0,00257	0,000028
Total	119	10,28805
TDA: Tiempo después de antesis. Resultados a partir de datos transformados con. *: Significativo (p £ 0,05) ns: no significativo (p > 0,05).

Cuadro 2. Prueba de promedios para el porcentaje de germinación del polen de Aloe vera y A. saponaria, bajo condiciones in vitro y diferentes tiempos después de la antesis.
TDA	A. vera	Ámbitos †	A. saponaria	Ámbitos †
0	50,57	a	45,50	c
1	50,85	a	46,04	b
2	49,14	bc	47,01	a
4	49,55	b	46,20	b
8	48,63	c	42,83	d
12	47,25	d	39,06	e
24	46,19	e	32,58	f
48	38,57	f	14,16	g
72	24,06	g	1,92	h
96	18,17	h	0,00	i
120	7,59	i	0,00	i
144	0,00	j	0,00	i
TDA: Tiempo después de antesis (horas). Los valores representan promedios de cinco repeticiones. † Prueba de ámbitos múltiples de Duncan (p £ 0,05), a partir de datos transformados con. Letras iguales indican promedios estadísticamente similares dentro de cada especie.

Cuadro 3. Análisis de varianza para el tiempo de germinación del polen (in vitro) entre las combinaciones de tratamientos (especies de Aloe-tiempos después de la antesis).
Fuente de variación	Grados de libertad	Suma de cuadrados	Cuadrados Medios	F
Repeticiones	4	0,025	0,006	2,32 ns
Combinaciones	19	90,395	4,758	1769,93 *
Error Experimental	76	0,204	0,003
Total	99	90,624
Resultados a partir de datos transformados con. *: Significativo (p £ 0,05) ns: no significativo (p > 0,05).

Cuadro 4. Prueba de promedios para el tiempo de germinación (min) del polen de Aloe vera y A. saponaria, bajo condiciones in vitro y diferentes tiempos después de la antesis.
TDA	A. vera	Ámbitos †	A. saponaria	Ámbitos †
0	11,11	a	13,88	d
1	11,70	b	14,16	de
2	11,90	bc	14,17	de
4	12,34	c	14,11	d
8	12,39	c	15,03	fg
12	13,97	d	15,49	gh
24	14,69	ef	19,20	i
48	15,66	h	27,10	k
72	19,32	i	57,19	l
96	23,52	j
120	27,47	k
TDA: Tiempo después de antesis (horas). Los valores representan promedios de cinco repeticiones. † Prueba de ámbitos múltiples de Duncan (p<0,05), a partir de datos transformados con . Letras iguales indican promedios estadísticamente similares entre todos los tratamientos.

En general, el crecimiento del tubo polínico estuvo afectado negativamente por el tiempo de almacenamiento del polen antes del cultivo in vitro. Esto puede ser provocado por numerosos factores, entre ellos, el agotamiento de las proteínas de reserva en el grano de polen (Tanaka y Wakabayashi, 1992), o el cese de actividades enzimáticas encargadas de la elongación de la pared del tubo polínico (Li y Linskens, 1983; Geitmann et al., 2000). En angiospermas, la germinación y desarrollo del tubo polínico está ya predeterminado en el grano de polen, al tiempo que son liberados en la antesis. Los ribosomas, ARNm y ARNt, requeridos para la germinación, son sintetizados durante la maduración del polen y persisten hasta que son empleados para el proceso germinativo. Esta germinación y el rápido desarrollo del tubo polínico, así como, la presíntesis de ARNm y síntesis de proteínas, varían entre las especies vegetales (Mascarenhas, 1975, 1978). La alteración de estos procesos bioquímicos durante el almacenamiento del polen, debe contribuir en la respuesta diferencial observada en las especies de Aloe, siendo el polen de A. saponaria el más sensible a los efectos perjudiciales del envejecimiento.

Otras especies vegetales como Crotalaria retusa (Shivanna et al., 1990, 1991) y Malus domestica (Bellani et al., 1984), han conservado el poder germinativo de sus granos de polen, aún luego del almacenamiento durante 30 y 365 días, respectivamente. Obviamente, la longevidad del polen en estas especies deber estar asociada a una mayor capacidad de latencia y a la protección proporcionada por una cubierta mucho más impermeable y robusta que la presente en Aloe (Steyn et al., 1998).

Finalmente, desde el punto de vista de la aplicación de estos resultados, es recomendable realizar cualquier tratamiento mutagénico durante las primeras 24 horas después de haber colectado el polen en antesis y ejecutar los cruzamientos lo más rápido posible, a fin de garantizar la germinación del polen y obtención de progenies. Por otra parte, debe tomarse en cuenta, que además de los efectos nocivos del tiempo, las irradiaciones u otros procedimientos que conlleven a la mutagénesis de estas células, seguramente reducirán también su capacidad germinativa, por lo cual se deberá emplear el polen inmediatamente después del tratamiento.

CONCLUSIONES

El medio de cultivo a base de agar-agar (4 g.l^-1) y sacarosa (0,06 mol.l^-1) resultó adecuado para evaluar la germinación in vitro del polen de Aloe vera y A. saponaria. La capacidad germinativa del polen, bajo condiciones in vitro, alcanzó la inhibición completa entre 120 a 144 h después de la antesis en A. vera y entre 72 a 96 h en A. saponaria. Para la inducción de mutaciones, se recomienda realizar los tratamientos durante las primeras 24 h después de la colecta del polen en antesis.

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Página diseñada por: Prof. Jesús Rafael Méndez Natera

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