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Revista Científica UDO Agrícola Volumen 6.
Número 1. Año 2006. Páginas: 60-66
Desinfección de ápices de
yuca (Manihot esculenta Crantz) cv.
‘Querepa Rosada’ con hipoclorito de sodio
Disinfection
of cassava (Manihot esculenta Crantz) shoots cv. ‘Querepa Rosada’ with sodium hypochlorite
José
Alberto Laynez Garsaball* y María Claudia Sánchez Cuevas
Escuela de Ingeniería Agronómica. Núcleo Monagas. Universidad de Oriente.
Avenida Universidad. Campus Los Guaritos. Maturín, 6201. Monagas,
Venezuela. E-mails: jalaynezg@yahoo.es
y mariaclaudia@cantv.net. * Autor para
correspondencia
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Recibido: 09/06/2006 |
Fin de arbitraje: 22/08/2006 |
Revisión
recibida: 24/10/2006 |
Aceptado:
26/11/2006 |
RESUMEN
Esta investigación tuvo por
objetivo determinar un protocolo de desinfección de ápices de yuca del cultivar
Querepa Rosada, con soluciones de hipoclorito de sodio bajo tres
concentraciones y tres tiempos de inmersión. Se emplearon ápices meristemáticos
de
Palabras Claves: Contaminación, cultivo de tejidos, yuca, desinfectante, cloro
ABSTRACT
This
research was conducted in order to develop a disinfection protocol for apical
shoots of cassava, cultivar ¨Querepa Rosada¨, using three dilutions of sodium
hypochlorite and three immersion periods. Meristems, 1mm long, from apical
shoots collected in a commercial cassava plantation located in Jusepin,
Key words: Contamination,
cassava, tissue culture, disinfectant, chlorine
INTRODUCCIÓN
La yuca ha adquirido
importancia en los últimos años, debido a los distintos usos que pueden darse a
la misma (Industrial: obtención de almidón y alcohol; consumo humano: raíces
frescas, casabe, hojuelas, gofio, naiboa, mañoco y cerveza; y consumo animal:
sustituto de cereales). Sin embargo, el incremento del área de cultivo se ha
visto limitado por la insuficiencia de semilla, ya que la producción de propágulos es
limitada. Esto obedece a que el sistema
tradicional de propagación es por estacas y el factor de multiplicación
planta/año varía entre 10 y 20, es decir, una planta
madura produce entre 10 y 20 estacas de
Se ha demostrado que la técnica del cultivo de tejidos es apropiada para la rápida y masiva propagación de plantas. La regeneración de plantas enteras a partir de ápices meristemáticos de yuca es una técnica bien establecida con beneficios adicionales a la propagación, como lo son: la eliminación de patógenos, almacenamiento in vitro y el intercambio internacional de germoplasma. Uno de los mayores inconvenientes en el cultivo de tejidos es la contaminación, la cual puede tener origen en diversas fuentes: el material vegetal, el área de trabajo, los instrumentos o herramientas, la vidriería, e inclusive, el propio investigador. Los tallos o estacas de la yuca, expuestos a la contaminación durante el largo ciclo de desarrollo del cultivo, están generalmente infectados de patógenos fungosos, bacterianos y virales, especialmente cuando la plantación de donde se tomaron está afectada (CIAT, 1982). Para el establecimiento de los explantes en condiciones in vitro, la limpieza del material es de primordial importancia. En el caso de los tejidos, los contaminantes que llevan las yemas sobre su superficie se eliminan con la desinfección. Si por el contrario se encuentran dentro del tejido, su eliminación es muy difícil, y en estos casos, es recomendada la inclusión de fungicidas y bactericidas en el medio de cultivo, o bien, el tratamiento de las plantas donantes de ápices meristemáticos con altas temperaturas (CIAT, 1980b).
El
éxito de las plantaciones rentables de yuca se inicia con la utilización de semilla de alta calidad, que represente fielmente la variedad, que sea vigorosa
y especialmente libre de plagas y enfermedades
(Mantilla, 1993). Algunas metodologías de desinfección de explantes de
yuca proponen el corte de los brotes entre 1 y
Sobre estas bases, el objetivo planteado en el presente trabajo, fue evaluar el efecto de la
desinfección de ápices de yuca del cultivar “Querepa Rosada”, con tres
concentraciones de hipoclorito de sodio y tres tiempos de inmersión.
MATERIALES
Y MÉTODOS
El presente
trabajo fue realizado en el Laboratorio de Biotecnología de
Obtención del material vegetal, corte, lavado y
desinfección de los brotes
Se
utilizaron brotes terminales de tallo de 3 ó
Aislamiento,
siembra e incubación de los ápices
En la
cámara de flujo laminar se removieron las estípulas hasta disponer de un ápice
de
Diseño
Experimental, variables evaluadas y análisis estadístico
Se utilizó un diseño estadístico completamente aleatorizado con 11 tratamientos, cada uno con 10 repeticiones, un explante por repetición y por tubo de ensayo. Los tratamientos estuvieron conformados por la combinación de las concentraciones 10, 20 y 30 % de cloro comercial, para 0,525; 1,05 y 1,575 % de hipoclorito de sodio (C10, C20 y C30, respectivamente), y los tiempos de inmersión: 10, 20 y 30 min (T10, T20 y T30, respectivamente). Se incluyeron además dos testigos: Etanol 70 % por 5 segundos y HgCl2 por 10 minutos. El efecto de los tratamientos se determinó a los 8, 16 y 24 días después de la siembra (dds), a través de la determinación del porcentaje de ápices vivos y no contaminados (sanos). Las diferencias entre los porcentajes en cada fecha de evaluación se determinaron mediante la prueba para comparar dos porcentajes en una misma evaluación, descrita en Sokal y Rohlf (1969), al 0,05 % de probabilidad.
RESULTADOS
Porcentaje de ápices vivos y no contaminados a los 8
dds
En
Porcentaje de ápices vivos y no contaminados a los
16 dds
En la Figura 2 se observa que los mayores
porcentajes de explantes vivos y no contaminados se alcanzaron en los
tratamientos: C10-T10, C10-T20, C20-T10, C20-T20 Y C30-T10 (80; 80; 90; 70; y 80 %, respectivamente),
los cuales fueron estadísticamente superiores al resto de los tratamientos y a
los testigos bicloruro de mercurio y etanol con 30 y 10%, respectivamente. Este
último estadísticamente inferior al anterior.
Porcentaje de ápices vivos y no contaminados a los 24 dds
En
Porcentaje de ápices contaminados a los 8, 16 y 24 dds
La
prueba de comparación de porcentajes detectó que el tratamiento con mayor contaminación a los 8, 16 y 24 dds fue el testigo etanol 70
% (60, 90 y 100 % de explantes contaminados, respectivamente), el cual fue
estadísticamente superior al resto de los tratamientos en los que únicamente se
observó contaminación en C10-T20 y C20-T10 (10 % y 10 % de explantes
contaminados, respectivamente) a los 16 y 24 dds (Datos no mostrados).
Los resultados obtenidos muestran que el proceso de desinfección con
hipoclorito de sodio se vio afectado por la concentración y el tiempo de
inmersión, apreciándose que la solución al 10 % por 20 min, pasó de un 100 % de
ápices vivos y no contaminados a los 8 dds a un 50 % a los 24 dds, siendo
estadísticamente igual en esta fecha al tratamiento con solución al 10 % por 10
min (80 % a los 8 dds y 50 % a los 24 dds).
Por lo tanto, este último tratamiento puede ser considerado una técnica
de desinfección aceptable basado en que, desde el punto de vista práctico, se
escoge el de menor concentración por menor tiempo, con la intención de que el
tejido sufra el menor daño posible dada la fitotoxicidad del cloro, logrando
conseguir una metodología de desinfección efectiva y a la vez económica, de
material donante proveniente directamente del campo.
La variación
existente entre las distintas metodologías de desinfección, aun con el empleo
de el mismo producto, (González et al., 2005;
CIAT, 1980b), posiblemente se deba al nivel de contaminación que presenta el
material vegetal de yuca de acuerdo con su procedencia. Al respecto, CIAT
(1980b), señaló que la concentración de microorganismos contaminantes presentes
en el tejido depende de las condiciones de crecimiento de las plantas donantes,
y que mayor número de microorganismos se encontrará en tejidos provenientes del
campo que del invernadero, y menos aun en tejidos provenientes de una cámara de
crecimiento controlado. Por consiguiente, es necesaria la determinación de un
protocolo de desinfección considerando
las condiciones particulares del material que se empleará como donante
del explante.
Concentraciones de
hipoclorito de sodio y tiempos de inmersión semejantes a los empleados en este
trabajo han sido utilizadas en la desinfección de otras especies. Al respecto, Sánchez-Cuevas y Salaverría (2004) al estudiar el control de la oxidación y la contaminación en el cultivo in vitro de fresa cv. Fresno, utilizando
los mismos tratamientos descritos para la desinfección de los ápices de yuca, encontraron que mayor efectividad con 20 % de hipoclorito de sodio durante 20 min, ya
que redujo la contaminación a 10 % y obtuvieron la mayor sobrevivencia (90 %)
de los explantes. Concentraciones más altas o períodos de inmersión más
prolongados causaron necrosis en el tejido. En igual forma, Guerra y
Otahola (2005) trabajaron en la desinfección de ápices de alpinia (Alpinia purpurata (Vieill) K. Shaum),
lavando los explantes con abundante agua de chorro durante 10 minutos,
sumergiéndolos en alcohol puro (98 % de pureza) durante un minuto, para después
colocarlos en tres concentraciones de cloro comercial (5,25 % de hipoclorito de sodio en soluciones
de agua:cloro 2:1, 3:1 y 4:1), combinados con tres tiempos de inmersión (10, 20
y 30 minutos). En las primeras evaluaciones realizadas observaron mayor
sobrevivencia de los explantes en el tratamiento donde se utilizó la menor
concentración de cloro y tiempos de inmersión de 10 y 20 minutos; mientras que
en la mayor concentración la sobrevivencia disminuyó indicando toxicidad del
cloro sobre los explantes. Estos trabajos señalan un efecto perjudicial del
cloro sobre los explantes producto del aumento de la concentración, o bien, del
incremento en el tiempo de inmersión. En la presente investigación fue posible
observar que los periodos de inmersión de 10 y 20 minutos en combinación con
las concentraciones de hipoclorito de sodio de 10 y 20%, así como también la
combinación 10 minutos de inmersión a concentración de 30%, presentaron los
mayores porcentajes de explantes vivos y no contaminados a los 16 y 24 dds,
sugiriendo que la disminución en este porcentaje estuvo determinada por el
tiempo de inmersión más que por las concentraciones de hipoclorito de sodio.
La inclusión como testigo del HgCl2 (inmersión 10 minutos) no
resultó ser un buen tratamiento de desinfección al evaluar la mejor combinación
del bajo porcentaje de explantes contaminados y una alta sobrevivencia, ya que
aun cuando no se presentó contaminación en ninguno de los explantes tratados en
las tres fechas de evaluación con este producto, los porcentajes de
sobrevivencia a los 24 dds fueron muy bajos (20 %). Esto demostró su alta
toxicidad, aspecto que reafirma Contreras (1991), al señalar que dentro de los
desinfectantes más comunes, el cloruro de mercurio y el nitrato de plata son
unos de los menos usados por su toxicidad, y en relación a efectividad, los
mejores son los hipocloritos y el agua de
bromo, seguidos por el peróxido de hidrógeno y el nitrato de plata. Por otra parte, Suárez (1997) indicó que cualquiera sea la metodología
seguida para el proceso de desinfección, los tratamientos con soluciones
desinfectantes que se usen, deben permitir retener la capacidad biológica de
los tejidos y al mismo tiempo destruir cualquier contaminante fúngico o
bacteriano.
El tratamiento con hipoclorito de
sodio mostró ser muy efectivo para la desinfección superficial, es decir, para
el control de los microorganismos contaminantes externos del material vegetal,
en todas las concentraciones y tiempos de inmersión en estudio, ya que no se
apreció la aparición de microorganismos en un lapso de 8 días después de la
siembra, tiempo suficiente para el crecimiento de bacterias y hongos. La poca
contaminación observada en las evaluaciones posteriores (16 y 24 dds) puede
atribuirse a infecciones internas de los tejidos, no controlables por los
tratamientos aplicados. Esto se corresponde con el CIAT (1982), al señalar que
los tallos o estacas de yuca se encuentran expuestos a la contaminación durante
el largo ciclo de desarrollo del cultivo, por lo que están generalmente
infectados de patógenos fungosos y bacteriales, y que algunas
bacterias y casi todos los virus son sistémicos en la planta. Así mismo, el
CIAT (1980b) afirmó que en el caso de los tejidos, los contaminantes que llevan
las yemas sobre su superficie se eliminan con la desinfección, pero si los
contaminantes se encuentran dentro del tejido, su eliminación es muy difícil y
en estos casos se recomienda la inclusión de fungicidas o bactericidas en el medio
de cultivo; aunque Suárez (1997) indicó que generalmente se considera que los
tejidos de las plantas intactas y sanas son asépticos internamente y que la
principal tarea de limpieza esta limitada a la desinfección superficial.
En
este trabajo se pudo observar también que en la medida en que se incrementó el
tiempo de inmersión de los explantes en las distintas concentraciones de
hipoclorito de sodio, disminuyó la sobrevivencia. Esto puede ser debido a dos
efectos. Uno directo relacionado con la toxicidad del producto a nivel
celular; y uno indirecto porque el
tejido se torna gomoso al incrementar la concentración de cloro, dificultando su manipulación, y por ende, el deterioro del
explante. En este sentido, Díaz (2000) observó que todos los explantes de
especies del género Pasiflora tratados con hipoclorito de sodio por 30
minutos estaban necrosados después de tres días de la siembra. Igualmente
Sánchez-Cuevas y Salaverría (2004) al tratar explantes de
fresa con hipoclorito de sodio al 30% (30 minutos), evidenciaron la ausencia de
contaminación, pero no recomendaron su utilización porque la sobrevivencia fue
baja indicando que este tratamiento fue tóxico para los explantes.
CONCLUSIONES
1.
Para lograr un 50% de explantes vivos y no contaminados a
los 24 dds, fue necesario que previo a la desinfección, los brotes se lavaran
con agua corriente (30 min), luego fueron sumergidos en una solución de
detergente líquido (5 minutos en agitación constante) y finalmente en fungicida
Kumulus DF (3g/L por 30 min); posteriormente en la cámara de flujo laminar se
desinfectaron con una solución al 10 % (v/v) de
hipoclorito de sodio comercial (5,25%) durante 10 min, y se enjuagaron
tres veces con agua destilada estéril, manteniendo los brotes hidratados hasta
el momento de aislar los explantes.
2.
El testigo HgCl2 (inmersión 10 min) no resultó
ser un buen tratamiento, porque a pesar de que controló en 100% la
contaminación, los porcentajes de
sobrevivencia a los 24 dds fueron muy bajos (20 %).
3.
Incrementos del tiempo de
inmersión de los explantes en las distintas concentraciones de hipoclorito de
sodio, redujo el porcentaje de sobrevivencia, ya que afectaron la consistencia
del explante, al tornar su tejido gomoso, lo cual dificultó su manipulación.
AGRADECIMIENTO
Al
Instituto de Investigaciones Agropecuarias y al Postgrado en Agricultura
Tropical del Núcleo Monagas de la Universidad de Oriente.
LITERATURA CITADA
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). 1980a.
Sistema de
propagación rápida de la yuca. Serie 05-06-01. Cali, Colombia. 20 pp.
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). 1980b.
El Cultivo de meristemas de yuca. Serie 04SC-02.02. Cali, Colombia. 40 pp.
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). 1982. Primer Taller
Latinoamericano sobre Intercambio de Germoplasma de Papa y Yuca. (Memorias). Serie
03SC-6(82).
Cali, Colombia. 295 pp.
Contreras, I. 1991. Biotecnología vegetal. Universidad de
los Andes. Facultad de Ciencias Forestales. Laboratorio de cultivos in vitro. Mérida, Venezuela. p. 37-39.
Díaz, G., M. J. 2000. Regeneración de dos especies del
género Pasiflora en cultivo de tejidos in vitro utilizando dos tipos de explantes de plantas adultas.
Trabajo de Grado. Escuela de Ingeniería
Agronómica. Universidad de Oriente. Maturín, Venezuela. p. 14.
Guerra, D. y V. Otahola, 2005. Desinfección de ápices de
alpinia (Alpinia purpurata (Vieill)
K. Shaum) para establecimiento de cultivo in
vitro. In: J. Mayz; N. Alcorcés y A. Lárez (Eds.). Memoria del XVI Congreso
Venezolano de Botánica. Maturín, del 15 al 20 de mayo del 2005. Revista Saber
(Suplemento) 17: 131-133.
González, O.; J. Albarrán; G. De Martino y F. Fuenmayor.
2005. Propagación y conservación in vitro
de clones de yuca a partir de diferentes tipos de explantes. In: J. Mayz; N. Alcorcés y A. Lárez (Eds.).
Memoria del XVI Congreso Venezolano de Botánica. Maturín, del 15 al 20 de mayo
del 2005. Revista Saber (Suplemento) 17: 127-130.
Kartha, K. K. 1984. Cassava
tissue culture. In Micropropagation
of selected rootcrops, palms, citrus and ornamental species. FAO/NORWAY. Roma. p. 50-67.
Mantilla, J. E. 1993. Aspectos agronómicos del cultivo de
yuca en Venezuela. In: VIII Encuentro
Nacional de Productores e Investigadores del Cultivo de
Murashige T. and F. Skoog.
Sánchez-Cuevas, M. y J. Salaverría. 2004. Control de la oxidación y la
contaminación en el cultivo in vitro de fresa (Fragaria X ananassa
Duch.). UDO Agrícola 4 (1): 21-26.
Sokal, R. y J. Rohlf .1969. Biometría:
Principios y métodos estadísticos en la investigación biológica. H. Blume.
Madrid, España. p. 127-129.
Suárez, A. E. 1997. Métodos de asepsia y esterilización. In: M. Perea y J. Cedeño (Eds.). Cultivo
de Tejidos Vegetales y sus Aplicaciones en
Página diseñada por: Prof. Jesús Rafael Méndez Natera
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